流動化學在各種領(lǐng)域都有應用，并且具有改進許多化學過程的潛力。在過去的 15 年中，隨著商用設(shè)備的發(fā)展以及學術(shù)文獻的增加和工業(yè)界的采用，這些使能技術(shù)在研究和開發(fā)應用中的使用迅速增加。

連續(xù)流生物催化領(lǐng)域正迅速成為化學家關(guān)注的關(guān)鍵領(lǐng)域，其應用領(lǐng)域包括精細化學品、藥物、生物治療劑和生物燃料等。這反映在現(xiàn)代實驗室中流動技術(shù)的采用以及工業(yè)和學術(shù)界對這些技術(shù)的更多了解上。連續(xù)流動生物催化的使用在過去幾年中顯著增加的出版物數(shù)量中得到了證明。

為什么要進行連續(xù)流生物催化？

在傳統(tǒng)的生物催化系統(tǒng)中，間歇攪拌釜反應器是最常見的方法，這是最廣泛使用的反應器類型。然而，該方法具有相對較低的體積生產(chǎn)率并且酶與攪拌器和葉輪的碰撞導致酶的降解和磨損。在間歇反應中使用游離酶會受到生物催化劑循環(huán)和回收的限制。

流動化學可以提供很多東西，并顯示出與傳統(tǒng)方法相比的幾個優(yōu)勢。該方法具有提高生物轉(zhuǎn)化率的潛力，因為它增加了傳質(zhì)，通過減少反應時間和增加材料產(chǎn)量使其使用更經(jīng)濟。酶的固定化可提高穩(wěn)定性，減少產(chǎn)品純化，更好地控制底物接觸時間，其可回收性降低成本并擴展其生產(chǎn)適用性。

作為一項既綠色又可持續(xù)的技術(shù)，學術(shù)界和工業(yè)界現(xiàn)在正專注于持續(xù)生產(chǎn)。微型流動反應器用于連續(xù)處理，因在密閉空間中嚴格控制的條件下進行反應。生物催化采用小型化流動反應器中運行的連續(xù)流動技術(shù)優(yōu)點：

1.減少環(huán)境影響、改善傳熱和傳質(zhì)以及高能效；

2.通過延長反應時間或構(gòu)建串聯(lián)和/或并聯(lián)反應器來輕松增加容量；

3.降低與危險中間體積累和儲存相關(guān)的風險，因為它們的瞬時量低于安全限制； 4.與在攪拌條件下使用固定化酶相比，減少了酶活性的磨損；

5.反應參數(shù)（溫度、壓力、流速）設(shè)置和監(jiān)測導致更可靠和可重復的過程。

全細胞與純化蛋白

有兩種一般類型的生物催化，全細胞和純化的蛋白質(zhì)生物催化。全細胞催化使用整個生物體，例如大腸桿菌（E.coli）進行轉(zhuǎn)化，而純化的蛋白質(zhì)生物催化使用提取的蛋白質(zhì)而沒有細胞存在。

全細胞生物催化依賴進出細胞的底物進行轉(zhuǎn)化。全細胞催化有兩種方法：發(fā)酵和生物催化?；瘜W家感興趣的是生物催化。全細胞生物催化的優(yōu)點是它比使用純化的蛋白質(zhì)便宜，缺點是細胞膜限制了底物和產(chǎn)物的滲透，使反應比純化的蛋白質(zhì)更慢，

然而，純化酶的優(yōu)勢在于其轉(zhuǎn)化具有特異性，但這使得酶通常對底物具有相當?shù)奶禺愋?。當使用純化的酶時，底物只需要擴散到蛋白質(zhì)的活性位點，而不是穿過細胞膜。此外，與全細胞相比，與相同質(zhì)量相比，所需酶的濃度更高。然而，純化過程可能很昂貴，有時這些純化的蛋白質(zhì)在細胞結(jié)構(gòu)之外可能不穩(wěn)定。

雖然兩種類型的生物催化都用于連續(xù)流動系統(tǒng)，但固定化酶的使用在該應用中顯示出最大的優(yōu)勢。

固定化酶

有多種固定酶的方法，理想情況下，它們應顯示相同的特性。大多數(shù)有幾個，包括；

· 大表面積

· 化學和熱穩(wěn)定性

· 適合（且足夠）用于連接的官能團

·易于再生

· 不溶于水

· 剛性和機械強度

· 低成本

· 最基本的固定技術(shù)是截留、吸附、共價、親和、交聯(lián)和封裝，如下所示。

生物催化劑在固體載體（或載體）上的吸附依賴于蛋白質(zhì)或細胞與固定載體之間的疏水、鹽橋、范德華力和氫鍵相互作用。吸附更容易進行，并且可以通過對蛋白質(zhì)的最小變形來避免酶變性。然而，固定壽命和效率可能低于可比較的共價固定。

在共價結(jié)合（covalence）的情況下，支撐材料被活性基團（例如胺、環(huán)氧基等）官能化，并且酶通過它們與表面共價結(jié)合。共價固定的主要好處是由于減少了浸出而有可能提高催化劑壽命。

親和固定圍繞在不同條件下對固定支持物具有不同親和性的酶展開。

通過與固定載體的共價或非共價相互作用將生物催化劑捕獲到籠狀網(wǎng)絡(luò)中來實現(xiàn)捕獲固定。其中一種方法是直接固定在微通道壁上。另一種方法利用酶固定在微通道內(nèi)的固體支持物上，例如在微米和納米粒子、多孔聚合物整料或膜上。

酶級聯(lián)

連續(xù)流動化學對酶催化級聯(lián)反應產(chǎn)生了令人印象深刻的影響，為生物合成和生物分析應用打開了新的潛在途徑。生物催化級聯(lián)反應是模仿自然活動和合成途徑的原子經(jīng)濟和節(jié)能過程。在連續(xù)運行的流通系統(tǒng)中級聯(lián)反應的性能包括進一步的積極特性，例如改進的傳質(zhì)和傳熱以及更好的反應物混合，例如提高反應速率和使生物催化劑由于缺乏高剪切應力。此外，生物催化劑的活性增加，例如通過精確控制與反應器體積相關(guān)的停留時間來避免底物和產(chǎn)物抑制。通過將此策略與實時監(jiān)控相結(jié)合，可以實現(xiàn)進一步的決定性優(yōu)勢，從而不僅可以更好地了解整個過程，還可以更好地了解構(gòu)成級聯(lián)的各個步驟。

連續(xù)運行的流動系統(tǒng)中的多酶級聯(lián)可以顯著提高所考慮的生物催化過程的效率和生產(chǎn)力。最近，Lauterbach 及其同事將亞胺還原酶與二胺氧化酶結(jié)合，并將這些酶固定在聚合物涂層的玻璃多孔載體上。酶促級聯(lián)在連續(xù)流動反應器中進行，H 2和O 2均通過電解產(chǎn)生并通過透氣膜轉(zhuǎn)移到流動系統(tǒng)中。酶促級聯(lián)建模使我們能夠了解參數(shù)的影響并在運行級聯(lián)以進行連續(xù)合成時對其進行優(yōu)化。芬尼根等人。結(jié)合機械和經(jīng)驗建模來優(yōu)化用于連續(xù)還原胺化的雙酶系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的一次一個因素（OFAT）方法相比，多維優(yōu)化顯示出明顯的優(yōu)勢。此外，這些模型的可用性可以通過 github 等現(xiàn)代公共平臺進行擴展，并且可以使用基于云的 Python notebook 進行操作。在我們看來，這些在硅方法是流通式生物技術(shù)的重要突破性發(fā)展。由于研發(fā) (R&D) 部門的成本較低，因此節(jié)省的時間有助于工業(yè)規(guī)模的酶促反應的突破。有這些模型工作的電腦，需要基本的實驗驗證動力學數(shù)據(jù)。

實時監(jiān)控在連續(xù)流動模式下操作的化學過程的優(yōu)點是集成、快速且易于執(zhí)行實時分析、優(yōu)化和放大。事實上，可以通過實時監(jiān)控評估多個參數(shù)并獲得即時反饋。這種稱為“過程分析技術(shù)”(PAT) 的策略可以輕松確定因果關(guān)系以及每個變量如何影響過程。實時監(jiān)測所需的所有設(shè)備，例如樣品稀釋器、溶劑交換和去除裝置，都可以放置在采樣和分析之間。今天，有多種用于流量設(shè)備的分析技術(shù)、工具和傳感器可用且適用。其中，在線高效液相色譜（HPLC）是應用最廣泛的分析方法之一，其通用性強，實施時間短，易于理解。其他經(jīng)常使用的監(jiān)測技術(shù)是實時氣相色譜 (GC) 和質(zhì)譜 (MS)。此外，內(nèi)聯(lián)紅外 (IR) 和衰減全反射傅里葉變換紅外 (ATR-FTIR) 光譜也得到了廣泛應用。幸運的是，這種光譜技術(shù)允許在反應過程中跟蹤受關(guān)注的反應物和產(chǎn)物的濃度變化，并且有利地觀察一些否則無法檢測到的中間體的形成。最近一個有趣的實時應用程序使用了一種在化學實踐中早已建立的方法：核磁共振 (NMR)。這種非常強大的非破壞性和定量分析策略被用作實時監(jiān)測儀器，稱為“臺式核磁共振”單元，特別有用。重要信息，尤其是在生物事件中，例如使用該光譜可以輕松獲取蛋白質(zhì)折疊、代謝途徑、翻譯后蛋白質(zhì)修飾和酶活性。臺式核磁共振能夠以流動模式運行實驗，它基于永磁體的存在，其主要優(yōu)點是占地面積小、幾乎零維護和易于操作。通常，它在制備色譜中用作在線檢測器，允許以簡單快速的方式監(jiān)測和量化物質(zhì)。

流動輔助合成技術(shù)（FAST）作為工業(yè)裝置：FAST系統(tǒng)由 Rahman等人提出。作者成功地使用 FAST 加氫連續(xù)平臺在低壓 H 2水溶液中進行更環(huán)保的芳族硝基還原反應。（生物）催化界將進一步見證學術(shù)界和工業(yè)界的發(fā)展，以加快化學品生產(chǎn)的研究和技術(shù)實施階段。

連續(xù)流自優(yōu)化平臺 如今，工業(yè)過程基于連續(xù)的生產(chǎn)過程以及將生產(chǎn)與物流聯(lián)系起來的持續(xù)數(shù)字化。這個“工業(yè) 4.0”領(lǐng)域的特點是數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)存儲和機器學習算法。新視角可以與連續(xù)流動化學完美結(jié)合，促進對反應時間、溫度和成分的卓越控制，這些一直是流動過程的基石。最近的技術(shù)導致了具有集成智能算法的自動化平臺的開發(fā)，這些算法能夠控制優(yōu)化過程并最大限度地減少所需的人工注意力。從長遠來看，這種策略將使更快、更輕松地實現(xiàn)理想過程并避免人為偏見成為可能。與自動自優(yōu)化平臺相關(guān)的主要缺點是它們在開發(fā)時考慮了單一和特定的過程。不幸的是，直到現(xiàn)在，通過組裝來自不同制造商的設(shè)備和工具來設(shè)計一個通用的、全自動的系統(tǒng)仍然是一個挑戰(zhàn)，因為在大多數(shù)情況下，它們將使用不平等和不兼容的通信方法。在此基礎(chǔ)上，現(xiàn)在的注意力集中在如何從軟件角度開發(fā)模塊化或即插即用系統(tǒng)，從而實現(xiàn)更好的設(shè)備控制和不同硬件組件的集成以實現(xiàn)過程強化。希望在從過去的數(shù)據(jù)和錯誤中學習以指導實驗的算法的寶貴幫助下，連續(xù)流動過程將很快實現(xiàn)。

下游處理

通常連續(xù)生物催化的主要焦點集中在流動系統(tǒng)本身的開發(fā)和改進上。我們認為，到目前為止，下游處理 (DSP) 并未受到同等程度的關(guān)注，盡管在開發(fā)連續(xù)流動化學的同時，連續(xù) DSP 也獲得了一些關(guān)注。此處的開發(fā)目標主要是提高工藝效率、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量并降低空間要求和商品成本。這種新方法已應用于純化最終產(chǎn)品的生物制藥。連續(xù)方法可以使用各種技術(shù)和工具進行，例如連續(xù)離心、深度過濾或切向流過濾 (TFF)，代表制造規(guī)模的初級澄清技術(shù)。關(guān)于生物大分子的分離和純化，可以參考 Vicente等人最近發(fā)表的教程評論。

然而，迄今為止最常用的連續(xù)DSP技術(shù)是連續(xù)色譜法。連續(xù)色譜受益于兩個主要優(yōu)點：首先，處理量減少，其次，對不穩(wěn)定化合物的耐受性更強。因此，連續(xù)流動操作可以在更小的柱子內(nèi)改進更多的純化循環(huán)，同時利用更短的處理時間，這是純化不太穩(wěn)定的蛋白質(zhì)時的主要優(yōu)勢。

通常，原位固相吸附可用于連續(xù)流動生物催化。雖然現(xiàn)在文獻中已經(jīng)適度使用了各種吸附材料，但研究領(lǐng)域仍然缺乏對大量市售吸附材料（和離子交換樹脂）的系統(tǒng)篩選。最近，von Langermann 及其同事提出了兩項研究，在搖瓶實驗中生物催化反應產(chǎn)物的 DSP 方面取得了有希望的結(jié)果，這些研究可以轉(zhuǎn)移到酶促連續(xù)過程中的應用。此外，原位產(chǎn)品回收技術(shù) (ISPR)，如原位產(chǎn)品結(jié)晶 (ISPC)和原位產(chǎn)物吸附 (ISPA) 有助于實現(xiàn)連續(xù) DSP。

非常規(guī)媒介

生物催化和綠色化學改變了我們進行化學合成的方式，尤其是在工業(yè)規(guī)模上。一方面，它們?yōu)檠芯款I(lǐng)域帶來了諸多優(yōu)勢，但另一方面，它們也引發(fā)了許多新的問題和疑慮。在酶促過程中，大多數(shù)生物催化劑在達到其最大活性的水性反應條件下運行最佳。相比之下，疏水性底物通常幾乎不溶于水環(huán)境，應用化學家的行動自由受到嚴重限制。

為了克服這些問題，有機溶劑中酶催化的子領(lǐng)域很早就形成了。1980 年代至 90 年代，該領(lǐng)域的先驅(qū)記錄了酶在非水介質(zhì)中的使用：Klibanov、Halling、Mattiasson 和 Adlercreutz。此外，在 2000 年代初，發(fā)表了關(guān)于離子液體 (IL) 中生物催化反應的第一篇論文。

最近，Wang 和同事研究了 16 種不同的離子液體作為微流體生物催化的助溶劑。作者使用了一種新型重組 RhaB1 酶（一種屬于糖苷水解酶家族 78 (GH78)的細菌 α- 1-鼠李糖苷酶）。沒有任何進一步的純化步驟，蘆丁水解產(chǎn)生異槲皮苷。使用連續(xù)流動的玻璃-PDMS 微通道反應器和膠體酶的水溶液，4 小時后重組 RhaB1 在微通道中聚集并堵塞通道。當 IL [Toma][Tf 2N]同時作為助溶劑，增加了RhaB1的溶解度和流動性，不發(fā)生團聚，微通道不堵塞。此外，作者證實了使用 IL 對 RhaB1 活性的積極影響。在最佳條件下，異槲皮苷產(chǎn)量約為。使用微通道反應器在 10 分鐘內(nèi)達到 99%。通過這項研究，作者能夠證明微反應器的缺點可以通過系統(tǒng)和智能地使用 IL 等助溶劑來克服。

Grollmisch等人的工作。最近證明了脂肪酶 CalB 在聚合離子液體 (PIL) 中的固定化，即使該材料尚未用于連續(xù)系統(tǒng)，也應在此處提及，但它無疑指明了前進的方向。此外，Villa等人。使用微流系統(tǒng)討論生物催化和 ISPR 中的非常規(guī)介質(zhì)。

“非常規(guī)介質(zhì)中的生物催化”（BNCM）的主題最近因使用深共熔溶劑（DES）作為生物催化中的有效溶劑和反應（共）介質(zhì)而得到加強。DESs在過去幾年中受到廣泛關(guān)注，它是一種新型溶劑，具有特殊的優(yōu)點，例如簡單快速的制備過程和多種可調(diào)性能。通過混合路易斯或布朗斯臺德酸和含有多種陰離子和/或陽離子物質(zhì)的堿獲得低共熔混合物。然而，與離子液體相比，最終溶劑具有較低的內(nèi)在毒性，使其成為有前途的替代品。它的主要缺點是高粘度（取決于起始材料）是工藝放大的一個問題，但可以通過將它們與其他（共）溶劑混合來輕松克服。在這種情況下，添加水/緩沖液（例如高達 20% v/v）已顯示粘度顯著降低。所有這些特性使 DES 特別適用于連續(xù)流動化學，其量身定制的特性使多級連續(xù)流動過程和級聯(lián)反應成為理想的選擇。

連續(xù)流光生物催化

使用光催化是一種優(yōu)雅的方法，在科學界引起了極大的關(guān)注。如今，與不依賴光的替代品相比，光催化已被證明可以在更溫和的條件下使用（過渡）金屬或有機催化劑來擴展底物范圍。在此，光催化反應利用光催化劑在其激發(fā)態(tài)時增強的反應性，例如允許與有機底物的單電子轉(zhuǎn)移（SET）過程，產(chǎn)生在有機合成中起關(guān)鍵作用的自由基。

越來越多的研究集中在光生物催化反應上，包括與光催化劑偶聯(lián)的酶以及嚴格依賴光的光酶只能在光照下催化反應最近，Schmermund等人和 Park 及其同事回顧了這個不斷發(fā)展的光生物催化研究領(lǐng)域。事實上，如今光驅(qū)動的酶促生物催化得到了廣泛的研究并且——在我們看來——光生物催化和連續(xù)流動化學的整合和整合似乎是拓寬這一有趣研究領(lǐng)域知識的下一個合乎邏輯的步驟。例如，連續(xù)流技術(shù)可以克服低光穿透深度和反應介質(zhì)內(nèi)光分布的不均勻性。結(jié)合兩個研究部分的優(yōu)點（和缺點）可以導致更有效的催化時代，我們假設(shè)概念驗證示例將在不久的將來發(fā)表。

結(jié)論與展望

生物催化和流動化學的融合正在進行并且正在增加。這是有道理的：高表面積與體積比、改進的混合和傳質(zhì)、卓越的溫度控制和小體積需要顯著減少的試劑量和更短的從構(gòu)思到應用的時間。所有這些有利的參數(shù)都將促進和激發(fā)研究。與經(jīng)典的“燒杯生物催化”相比，流動化學可以更加高效、資源高效、可控且環(huán)境友好。

在不久的將來，我們預計流動生物催化在學術(shù)界和工業(yè)界用于合成我們?nèi)粘Ｐ枰幕瘜W品的使用會急劇增加。尤其是生物催化反應規(guī)模縮小的機會，使得能夠以更資源高效的方式以高自由度篩選工藝參數(shù)的可持續(xù)方法成為可能。此外，流動反應級聯(lián)的模塊化而不是一鍋合成是一種特別有吸引力的途徑。特別是在制藥生產(chǎn)中，我們預計行業(yè)對流動生物催化的興趣會越來越大，因為流動生物催化可以在縮短上市時間方面發(fā)揮重要作用。

我們特別關(guān)注未來的前景，如3D打印技術(shù)、連續(xù)運行的反應器中的酶級聯(lián)和在線分析。此外，連續(xù)下游加工的未來發(fā)展以及在流動系統(tǒng)中使用非常規(guī)介質(zhì)將為成功和持續(xù)的進步做出貢獻。

連續(xù)流生物催化實例

固定化微生物對 β-酮酯的生物還原

在這個例子中，里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學的研究人員展示了一種有趣的替代方法，即通過固定化微生物2生物還原 β-酮酯。

該小組之前曾使用馬克斯紅酵母和紅酵母細胞在批量條件下成功生物還原 β-酮酯，并將條件轉(zhuǎn)移到連續(xù)流動方法。通過海藻酸鈣截留微生物的固定化使這種類型的系統(tǒng)更加堅固且易于重復使用和回收，這比使用無法回收的全細胞有很大的優(yōu)勢。使用這種方法，該小組以優(yōu)異的產(chǎn)率和高對映體過量（> 99％）獲得了β-羥基酯。通過改變 β-酮酯結(jié)構(gòu)和固定化微生物，還可以控制絕對立體化學。

O-乙酰氰醇的三步伸縮連續(xù)法對映選擇性制備

在研究化學系在英國劍橋大學，IBG-1：生物技術(shù)（德國），和INB（應用科學的亞琛工業(yè)大學）已經(jīng)證明了O型Acetylcyanohydrin的三個步驟的對映準備伸縮連續(xù)process3。這是特別有趣的，因為手性精細化學品的生物催化多步方法仍然很少見。

南極念珠菌 CalB 和擬南芥 AtHNL 用于穩(wěn)健的連續(xù)伸縮過程，包括原位 HCN 生成，然后添加醛。在隨后的氫氰化反應中觀察到高度立體控制。在線化學乙?；軌蚍€(wěn)定新形成的氰醇，并在三個步驟中獲得一類具有非常好的轉(zhuǎn)化率和 ee 值的 O-乙酰氰醇（75-99% 轉(zhuǎn)化率；40-98% ee）。

事實證明，該方法在反應時間（40 分鐘對 345 分鐘）和易于操作方面優(yōu)于批處理方案，打開了由于安全問題而經(jīng)常被忽視的反應。模塊化組件能夠準確控制兩個連續(xù)的生物轉(zhuǎn)化，安全處理原位產(chǎn)生的有害氣體，以及產(chǎn)品的在線穩(wěn)定性。

用于食品、香精和香料工業(yè)的香葉醇酯的合成

這個來自化學工程系（孟買化學技術(shù)研究所）的例子展示了香葉醇酯的合成，用于香水、香精和飲料行業(yè)?。

全球?qū)ο憔⑾闼拖憔男枨箢A計每年增長 3.9%，到 2020 年將達到 263 億美元。商業(yè)層面。隨著對綠色工藝的需求不斷變化，生物催化在該領(lǐng)域的應用已大幅增加。

在這項研究中，采用了固定化南極假絲酵母脂肪酶 B (Novozym 435) 的連續(xù)流動填充床反應器。研究了生物催化劑篩選等工藝參數(shù)的優(yōu)化，以及溶劑、摩爾比、溫度和?；w的影響。使用摩爾比為 1:1 的香葉醇和丙酸，在 70 °C 的 15 分鐘停留時間內(nèi)實現(xiàn)了約 87% 的丙酸香葉酯的最大轉(zhuǎn)化率。發(fā)現(xiàn) Novozym 435 是所有測試中最活躍和最穩(wěn)定的生物催化劑。

有一個普遍的誤解，認為酶不穩(wěn)定且價格昂貴，只能在高度稀釋的情況下工作，并且不能很好地進行可擴展的化學處理。然而，以連續(xù)方式進行的生物轉(zhuǎn)化數(shù)量不斷增加。它們?yōu)榛瘜W和生化問題提供了許多不同的解決方案，目的是提高復雜反應的選擇性和產(chǎn)率。

來源：

https://blog.syrris.com/2018/10/24/the-rise-of-biocatalysis-in-continuous-flow/

The rise of continuous flow biocatalysis – fundamentals, very recent developments and future perspectives

DOI：https://doi.org/10.1039/D0RE00335B

類別：continuous flow biocatalysis,生物催化，連續(xù)流動

Other: Combination of chemocatalysis and biocatalysis in flow